Ze studií byl vyloučen pro údajnou karikaturu jednoho z učitelů na zástěně u kamen, která však nebyla jeho dílkem. Bez maturity se nemohl hlásit na žádnou německou vysokou školu, přesto ze své iniciativy navštěvoval přednášky z fyziky, matematiky, chemie, ale také z biologie na univerzitě v Utrechtu. Röntgen vyloučení ze školy považoval za křivdu, ale chtěl si maturitu soukromně dodělat. Když však náhle onemocněl jeden ze zkoušejících byl náhradní učitel přizván právě ze školy, která Röntgena vyloučila a to byl jeden z důvodů, proč nakonec maturitu neudělal.
Přihlásil se na Vysokou školu technickou v Curychu, která přijímala své studenty i bez maturity na základě vstupní přijímací zkoušky. Studoval stavbu strojů a roku 1866 získal diplom strojního inženýra a o rok později ještě doktorát filozofie na curyšské univerzitě. V roce 1869 se stal asistentem profesora fyziky Augusta Kundta a odešel sním spolupracovat do Würzburgu. Od roku 1874 působil jako vynikající fyzik - experimentátor na vysokých školách, od roku 1876 jako profesor univerzity ve Štrasburku a od roku 1888 jako profesor na univerzitě ve Würzburgu a následně od roku 1900 na univerzitě v Mnichově. Využíval své znalosti konstruktéra pro vlastní realizaci prováděných pokusů. Zasáhl do mnoha oblastí fyziky a publikoval celkem 58 vědeckých prací.
Svou první vědeckou práci, týkající se plynů, publikoval Röntgen v roce 1870. Později zveřejnil práce z oblasti piezoelektrických a pyroelektrických vlastností krystalů. Röntgen mimo jiné popsal jev, kdy rotující dielektrikum v elektrickém poli má magnetické vlastnosti. Toto zjištění přispělo k formulování Lorentzovy elektronové teorie.
Nejvýznamnějších výsledků dosáhl při studiu katodových paprsků, kterými se zabýval od devadesátých let. Své pokusy prováděl velmi pečlivě a opakovaně. Zajímaly jej vlastnosti katodového záření a tak 8. listopadu 1895 zjistil, že v blízkosti jeho aparatury začalo bledozeleně světélkovat několik krystalů platnatokyanidu barnatého, přestože katodová trubice byla zabalená do černého papíru aby jej nerušilo světlo z výboje.Byla to patrně náhoda, která jak se říká přeje připraveným, ale stala se důležitým objevem. V místě, kam na sklo výbojky dopadalo katodové záření, vznikaly neznámé paprsky, které byly zpočátku označovány jako paprsky X. Tyto paprsky dokázaly prostupovat neprůhlednými látkami a mezi první rentgenové snímky patřila fotografie ruky jeho manželky s prstenem. Fotografie prozářené ruky byla publikována 22.12. 1895 ve francouzském časopise L´Illustration a vzbudila úžas a nadšení veřejnosti. Rentgen dlouho nemohl uvěřit tomu, že objevil nové záření. Najednou se stal celebritou zahrnutou poctami, nový objev se téměř okamžitě uplatnil v medicíně a defektoskopii. Paprsky X byly nazvány Röntgenovy paprsky.
Dne 10 prosince 1901 obdržel při prvním udílení Nobelových cen jako první tuto cenu za vynález nebo objev v oblasti fyziky. Celou částku 50 000 švédských korun, která byla součástí ceny, věnoval univerzitě ve Würzburgu. Svůj objev si nedal ani patentovat, protože jak prohlásil, chtěl svoje objevy přenechat lidstvu. Tyto peníze, stejně tak jako Röntgenův osobní majetek byly však znehodnoceny válečnou inflací a Röntgen zemřel 10. února 1923 v Mnichově zcela bez prostředků na rakovinu střev. Byl neskutečně skromným člověkem, odřekl dobře placenou hodnost akademika Berlínské akademie věd stejně jako vedení katedry fyziky na berlínské univerzitě nebo funkci prezidenta Fyzikálně-technického říšského ústavu. Nepřijal dokonce ani povýšení do šlechtického stavu.
Jeho objev ukázal cestu dalším více než 20 novým nositelům Nobelových cen a otevřel dveře k objevu stavby a struktury mnoha látek. Jeho jméno si objevené paprsky právem zaslouží.